质粒DNA提取攻略分享
质粒DNA提取
质粒（plasmid），是在细菌和其他细胞中发现的一种小型、环状DNA 分子，通常只携带少量基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因，可以在不同的细菌细胞之间传递。质粒是生物细胞内天然固有之一类核酸分子，其具备自主复制并能独立于寄主染色体的稳定遗传特性，广泛存在于原核细菌和真菌中，其中大多数为DNA型，少数为RNA型。
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，今天小编就介绍几种最常用的方法。
为什么要提质粒
因为天然质粒经过改造后，可以满足人类对基因工程中载体的几乎所有欲望，而在细菌（一般是经改造的工程菌，如大肠杆菌工程菌）中完成扩增的质粒需要简单、合理的办法从细菌中提取、纯化出来。
在基因工程中理想的载体需要具备以下条件：
第一，具备独立的复制起始位点，在宿主中容易复制；
第二，包含可供检测的选择性标记；
第三，具有多克隆位点，便于酶切及外源DNA的插入；
第四，不宜过大，便于操作。
质粒提取方法
质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1
碱裂解法
根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
2
煮沸法
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。
3
小量一步提取法
由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。
质粒提取方法选择
质粒提取的方法主要根据质粒DNA分子量的大小，所用细菌的种属，细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。
1、质粒DNA的分子大于15kb时，在质粒抽提过程中容易受损，可以采用比较温和的裂解方法，将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜，这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的压力，保护质粒DNA。
2、小分子的质粒DNA可以选用相对剧烈的方法来分离DNA。可以用煮沸法，碱裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢剂裂解细菌。这些方法会使DNA变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起，在恢复正常条件后，DNA便会复性。
3、对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用煮沸法。而这些碳水化合物在密度梯度中会紧靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的区带，因此很难避免，而这些碳水化合物可抑制多种限制酶的活性。这类菌株制备质粒时，不宜采用煮沸法。
4、菌株含有限制性核酸内切酶A的不宜使用煮沸法。因为煮沸不能使内切酶A完全失活，在后续实验中再用限制性内切酶消化时，质粒DNA会被降解。此时必须用酚：氯仿进行抽提。
煮沸法时间短，（特点）操作简单，时间短；（缺点）条件过于剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。
碱裂解法操作简单，（特点）所得质粒量较多且污染少，（缺点）花费的时间较长。
质粒提取试剂盒选择
常用的质粒提取试剂盒包括：OMEGA、BIOMIGA、Sigma、TaKaRa、Promega、天根、康为世纪、生工等。质粒提取可分为小提、中提、大提，适用于不同规模的菌液提取。
1
小提质粒
特点：简便、快速，适用于高通量提取。
浓度：100-200 ng/μl。
用途：适用于测序、PCR、腺病毒包装以及多数细胞转染实验。
适用场景：适用于1-5 ml菌液，提取简便、快速，可用于DNA序列分析、酶促反应、PCR等实验，要求质粒浓度不高。
2
中提质粒
特点：质粒DNA量较高。
浓度：0.7-1 μg/μl。
用途：适用于测序和多数细胞转染实验。
适用场景：适用于30-50 ml菌液，可用于酶切、PCR、测序、连接、转化等实验，提取的质粒浓度为0.7-1 μg/μl。
3
大提质粒
特点：质粒DNA量非常高，杂质少，无内毒素。
浓度：0.5-2 μg/μl。
用途：适用于慢病毒、腺相关病毒包装，以及多数细胞转染或其他需要大量质粒的实验。
适用场景：适用于100 ml - 500 ml菌液，适用于大规模提取，提取的质粒纯度高，无内毒素，可用于对质粒纯度有要求的实验。提取得到的质粒浓度为0.5-2 μg/μl。
质粒提取常见问题
01
为什么质粒得率低？
● 提取质粒的甘油菌使用错误对应抗性的培养基培养
● 菌体质粒拷贝数低或无质粒，菌质粒拷贝数低往往提取的质粒含量低，某些菌体在多次转接后可能出现质粒丢失的情况
● 碱裂解时间不充分，导致裂解不彻底，菌体中质粒未全部提取
02
基因组污染或蛋白质
● 加入裂解液时摇晃剧烈及裂解时间过长，菌体基因组未与菌体蛋白质,细胞壁相互缠绕形成复合物并与十二烷基硫酸盐结合成沉淀
● 离心白色絮状物时间不充分，导致上清液并不澄清混有蛋白质
● 不要使用过多菌体，导致上清液不够澄清
03
提取的基因质粒时间长了会降解？
● 质粒提取完成后避免反复冻融
● 质粒溶解时吹打混匀时避免吹打过力，造成机械损伤
● 最后溶解质粒时应在超净工作台避免引入核酸酶造成质粒降解
04
质粒纯度的选择
● 同样对于一般的载体构建等常规实验和送去测序检测的话，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。
● 如果是质粒需要用来做细胞转染实验的话，则需要无热源，无内毒素（LPS）
